Biologie médicale et biotechnologies - Institut des Maladies neurodégénératives : monoamines, Parkinson et douleur

Extraits

[...] La BSA permet la saturation des sites de liaisons non spécifiques aux Ag utilisés. Enfin, les coupes sont incubées pendant une nuit avec l'Ac primaire anti-TH dilue au 1/5000ème dans du PBS 1X contenant de BSA. Le jour qui suit, les coupes sont lavées au PBS 1X 4*5min pour éliminer l'Ac primaire non fixe et incubées dans une solution d'AC secondaire avec un Ac polymère HRP pendant 30min. Puis, un dernier lavage est effectué au PBS 1X 4*5min avant la révélation à la DAB. [...]

[...] Puis avant d'être montées, elles sont lavées 3x10min au PBS 1X. 2.3.2 Immunohistochimie - P-ERK La protéine ERK est interne au neurone, lorsqu'elle est phosphorylée, on dit qu'elle est activée. Cette IHC va alors nous servir à voir l'activation continue des neurones noradrénergiques par la détection p-ERK. Au début de mon stage, nous avons débuté avec le protocole classique sur des coupes de STN pour ne pas se servir de nos coupes d'intérêt, celle de locus. Les coupes sont lavées au PBS 1X pendant 10 min puis mises dans une solution de saturation et de perméabilisation avec du PBST + BSA pendant 30 min. [...]

[...] Cette technologie, couramment utilisée dans les laboratoires de recherche, combine deux disciplines, l'optique (utilisation d'un laser pour exciter ou inhiber les protéines photosensibles) et la génétique (faire entrer un gène à l'aide d'un virus dans le neurone) pour étudier les réseaux de neurones. Pour la chémogénétique, on utilise une molécule chimique (ligands) qui va activer la protéine cible (récepteur). Nous avons cherché valider le modèle expérimental de la maladie de Parkinson, souri injectée avec la neurotoxine 6-OHDA sur le plan histologique chez la souri ii) valider l'infection virale intracérébrale au niveau du locus c?ruleus et iii) caractériser l'activation des neurones de cette même structure en utilisant une approche d'immunohistochimie pour détecter les protéines c-fos et p-ERK. [...]

[...] Grâce à cette IHC, on va regarder l'activation des neurones du locus avant le sacrifice de l'animal. Nous avons choisi de tester directement avec le deuxième protocole car précédemment, avant mon stage, les IHC c-Fos avec le protocole classique ne fonctionnaient pas. Pour cela, les coupes sont lavées pendant 5min au PBS 1X, puis perméabilisées avec du PBS Triton à 0.3% (PBST) deux fois 5 min. Ensuite, la perméabilisation et la saturation également continuent avec du PBST et du NGS a pendant 90min. [...]

[...] Quant aux souris 6OHDA, elles doivent être lésées seulement en unilatéral donc nous devrions retrouver la présence de ces neurones seulement du côté opposé à l'injection, côté controlatéral. 1.1 Analyse caractéristique Nous avons fait cette IHC sur des coupes de STR. Figure 5 : Scan de coupes de STR, De la souri 87 6-OHDA, issu d'IHC DAB, marquant les neurones dopaminergiques Ici, on retrouve des coupes de striatum qui vont d'antérieur à postérieur. On constate que les neurones marqués par la DAB se situent uniquement du côté controlatéral. Du côté ipsilatéral, on a une inhibition de ces neurones. [...]